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Phenotypic and genotypic characterization of Brucella abortus biovar 4 isolates from cattle in Brazil
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Andrade, Rafaella Silva

; Pereira, Carine Rodrigues

; Filho, Paulo Martins Soares

; Souza, Patrícia Gomes de

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

; Minharro, Silvia

; Costa, Marisa da

; Dorneles, Elaine Maria Seles

; Lage, Andrey Pereira

Ciência Rural

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2023, Volume 53 Nº 6 elocation e20210564

Resumo: Pt En | Texto: Pt En | PDF: Pt | PDF: En

RESUMO: O objetivo do presente estudo foi caracterizar (fenotipicamente e genotipicamente) duas cepas de Brucella abortus identificadas como pertencentes ao biovar 4 isolada de bovinos no Brasil. As cepas foram isoladas de bursite cervical de bovinos dos estados do Pará e Rio Grande do Sul, respectivamente. Na identificação fenotípica, os isolados foram positivos na exigência de CO2, produziram H2S, foram resistentes à fucsina básica (20 µg / mL) e sensíveis à tionina (20 µg / mL e 40 µg / mL) e apresentaram antígeno de superfície M, mas o antígeno de superfície A foi ausente. Os isolados foram positivos na PCR para o gene bcsp31 (gênero específico) e na PCR - AMOS, ambos os isolados apresentaram perfil de banda consistente com B. abortus biovar 1, 2 ou 4. Além disso, ambos os isolados também apresentaram padrões de restrição idêntica à cepa de referência quando testada pelo omp2b PCR-RFLP. Na genotipagem usando Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) - MLVA (MLVA16), os isolados apresentaram diferenças em vários loci (Bruce42, Bruce19, Bruce04, Bruce16 e Bruce30); no Multiple Locus Sequence Typing (MLST), os isolados também exibiram diferenças na sequência tipo (ST), amostra 16/02 ST1 (2-1-1-2-1-3-1-1-1) e amostra 128/11 ST (22-1-1-8-9-3-1-1-1). A extensa tipagem de cepas de B. abortus isoladas de bovinos no Brasil por diferentes abordagens confirmou a rara ocorrência de B. abortus biovar 4 no país.

ABSTRACT: The aim of the present study was to characterize (phenotypically and genotypically) two strains of Brucella abortus identified as belonging to biovar 4 isolated from cattle in Brazil. The strains were isolated from cervical bursitis from cattle in the states of Pará and Rio Grande do Sul, respectively. In the phenotypic identification, the isolates were positive in CO2 requirement, produced H2S, were resistant to basic fuchsin (20 µg / mL) and sensitive to thionin (20 µg / mL and 40 µg / mL) and presented M surface antigen, but A surface antigen is absent. The isolates were positive in the PCR for the bcsp31 gene (genus-specific) and in the AMOS-enhanced PCR, both isolates showed a band profile consistent with B. abortus biovar 1, 2 or 4. Moreover, both isolates also showed restriction patterns identical to the reference strain when tested by the omp2b PCR-RFLP. In genotyping using Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) Analysis - MLVA (MLVA16), the isolates showed differences in several loci (Bruce42, Bruce19, Bruce04, Bruce16 and Bruce30); by Multiple Locus Sequence Typing (MLST), they also exhibited differences in sequence type (ST), strain 16/02 ST1 (2-1-1-2-1-3-1-1-1) and strain 128/11 ST (22-1-1 -8-9-3-1-1-1). The extensive typing of B. abortus strains isolated from cattle in Brazil using different approaches confirmed the occurrence of rare B. abortus biovar 4 in the country.

https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20210564

First report of putative Leishmania RNA virus 2 (LRV2) in Leishmania infantum strains from canine and human visceral leishmaniasis cases in the southeast of Brazil
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Rêgo, Felipe Dutra

; da Silva, Eduardo Sérgio

; Lopes, Valeriana Valadares

; Teixeira-Neto, Rafael Gonçalves

; Belo, Vinícius Silva

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

; Pereira, Diego Andrade

; Pena, Heber Paulino

; Laurenti, Márcia Dalastra

; Araújo, Gabriela V

; da Matta, Vânia Lúcia Ribeiro

; Chouman, Islam Hussein

; Burrin, Thainá Bergantin

; Sandoval, Carmen M

; Barrouin-Melo, Stella Maria

; de Pinho, Flaviane Alves

; de Andrade, Hélida Monteiro

; Nunes, Ramon Vieira

; Gontijo, Célia Maria Ferreira

; Soccol, Vanete Thomaz

; Klocek, Donnamae

; Grybchuk, Danyil

; Macedo, Diego Henrique

; do Monte-Neto, Rubens Lima

; Yurchenko, Vyacheslav

; Soares, Rodrigo Pedro

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

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2023, Volume 118 elocation e230071

Resumo: En | Texto: En | PDF: En

BACKGROUND Leishmania RNA virus 1 (LRV1) is commonly found in South American Leishmania parasites belonging to the subgenus Viannia, whereas Leishmania RNA virus 2 (LRV2) was previously thought to be restricted to the Old-World pathogens of the subgenus Leishmania. OBJECTIVES In this study, we investigated the presence of LRV2 in strains of Leishmania (L.) infantum, the causative agent of visceral leishmaniasis (VL), originating from different hosts, clinical forms, and geographical regions. METHODS A total of seventy-one isolates were screened for LRV2 using semi-nested reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) targeting the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) gene. FINDINGS We detected LRV2 in two L. infantum isolates (CUR268 and HP-EMO) from canine and human cases, respectively. MAIN CONCLUSIONS To the best of our knowledge, this is the first detection of LRV2 in the New World.

https://doi.org/10.1590/0074-02760230071

Evidence for current circulation of an ancient West Nile virus strain (NY99) in Brazil
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Siconelli, Márcio Junio Lima

; Jorge, Daniel Macedo de Melo

; Castro-Jorge, Luiza Antunes de

; Fonseca-Júnior, Antônio Augusto

; Nascimento, Mateus Laguardia

; Floriano, Vitor Gonçalves

; Souza, Fransérgio Rocha de

; Queiroz-Júnior, Eudson Maia de

; Camargos, Marcelo Fernandes

; Costa, Eliana Dea Lara

; Carvalho, Adolorata Aparecida Bianco

; Fonseca, Benedito Antonio Lopes da

Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical

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2021, Volume 54 elocation e0687-2020

Resumo: En | Texto: En | PDF: En

Abstract INTRODUCTION: In Brazil, West Nile virus (WNV) was first detected, in 2018, in horses with neurological disease. AIM: We report the first case of WNV infection in a horse from Ceará state and the complete genome sequence of an isolate from Espírito Santo state. Both infections occurred in 2019. METHODS: WNV was isolated from the tissues of a horse with neurological signs in Espírito Santo and sequenced by MiSeq. RESULTS: Phylogenetic analysis revealed that the isolate belongs to lineage 1a, clustering with the NY99 strain, a strain that has not circulated in the USA since 2005. CONCLUSIONS: Our findings reinforce the hypothesis that WNV has been silently circulating in Brazil for many years.

https://doi.org/10.1590/0037-8682-0687-2020 430 downloads

Risk factors for human Mycobacterium bovis infections in an urban area of Brazil
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Silva, Marcio Roberto

; Rocha, Adalgiza da Silva

; Araújo, Flábio Ribeiro

; Fonseca-Júnior, Antônio Augusto

; Alencar, Andrea Padilha de

; Suffys, Philip Noel

; Costa, Ronaldo Rodrigues da

; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo

; Guimarães, Mark Drew Crosland

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

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2018, Volume 113 Nº 8 elocation e170445

Resumo: En | Texto: En | PDF: En

BACKGROUND The World Health Organization (WHO) has classified human zoonotic tuberculosis (TB) due to Mycobacterium bovis as a neglected issue in the developing world. In a recent cross-sectional study in Brazil, three of 189 TB patients presented with a coinfection of M. bovis and M. tuberculosis and were selected as cases for this study. OBJECTIVE The aim was to evaluate risk factors (RF) for zoonotic TB in an urban area of Brazil in order to guide preventive programmes. METHODS A matched case-control study was carried out nested within a cross-sectional study. For each of the three cases, 14 age- and sex-matched controls (TB due to M. tuberculosis) were selected. FINDINGS Zoonotic potential exposures (ZE) and extrapulmonary TB (EPTB) were independently associated with zoonotic TB in multivariate analyses. CONCLUSIONS ZE by occupation and consumption of raw milk and derivative products that place individuals in direct and indirect contact with animals and their excretions/secretions increase the risk for zoonotic TB in Brazil, especially among those with EPTB. Therefore, measures such as efficient control of bovine TB, distribution of pasteurised milk and its derivative products, and the diagnosis and monitoring of zoonotic TB in humans are essential steps, especially in developing countries where bovine TB is enzootic, and further studies are necessary.

https://doi.org/10.1590/0074-02760170445 2022 downloads

Comparative study of Mycobacterium bovis primary isolation methods
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Issa, Marina de Azevedo

; Soares Filho, Paulo Martins

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

; Hodon, Mikael Arrais

; Santos, Lílian Cristian dos

; Reis, Jenner Karlisson Pimenta dos

; Cerqueira Leite, Rômulo

Brazilian Journal of Microbiology

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Mar 2017, Volume 48 Nº 1 Páginas 139 - 144

Resumo: En | Texto: En | PDF: En

Abstract For the definitive diagnosis of bovine tuberculosis, isolation of the etiologic agent is required. However, there is no consensus on the best methodology for isolation of Mycobacterium bovis in Brazil. This study evaluated the most used decontaminants and culture media in the country, in order to identify the best combination for the Brazilian samples. Three decontaminants - 2% sodium hydroxide (w/v), 0.75% hexadecylpiridinium chloride (w/v) and 5% sulphuric acid (v/v) and four culture media - 7H11 Middlebrook with additives and OADC supplement “A” (7H11 A), the same media with another supplement trademark (7H11 B), tuberculosis blood agar (B83) and Stonebrink's medium were compared. Regarding the isolation, there were no significant differences between the decontaminants and media combinations, except 7H11A combined to any decontaminant. However, the mean colonies score was significantly greater when the samples were decontaminated with 5% sulphuric acid and inoculated in 7H11 B or SB, without significant difference between them, although colonies appeared earlier on 7H11B than on SB. The trademark of OADC supplement influenced the isolation rate and the number of isolated colonies in Middlebrook 7H11. An incubation time of four weeks was required to detect all positive samples in 7H11 B after decontamination with 5% sulphuric acid but there was an increase in the number of colonies until the sixth week of incubation. Overall, the best strategy for the primary isolation of M. bovis from Brazilian samples was the decontamination with 5% sulphuric acid (final concentration) and inoculation in Middlebrook 7H11 medium formulated with OADC supplement “B”.

https://doi.org/10.1016/j.bjm.2016.07.026 1002 downloads

Comparison of nine DNA extraction methods for the diagnosis of bovine tuberculosis by real time PCR
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Moura, André

; Hodon, Mikael Arrais

; Soares Filho, Paulo Martins

; Issa, Marina de Azevedo

; Oliveira, Ana Paula Ferreira de

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

Ciência Rural

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Jul 2016, Volume 46 Nº 7 Páginas 1223 - 1228

Resumo: Pt En | Texto: Pt En | PDF: Pt | PDF: En

RESUMO: A tuberculose bovina é uma doença infecciosa com um alto impacto na pecuária, particularmente em países em desenvolvimento. A PCR é um método muito sensível para a detecção de agentes infecciosos, mas a sensibilidade do diagnóstico molecular é em grande parte dependente da eficiência dos métodos de extração de DNA. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de extração de DNA para detecção direta de Mycobacterium bovisem tecido bovino. Nove kits comerciais para extração de DNA foram avaliados, quando combinados com duas PCRs em tempo real. O Kit Dneasy Blood & Tissue da Qiagen apresentou melhor desempenho e sensibilidade, seguido dos kits DNA Mini RBC e FTA Elute Micro Card (protocolo modificado com digestão enzimática prévia). Os resultados sugerem que, mesmo quando a sensibilidade analítica do qPCR é muito elevada, o método de extração pode influenciar na sensibilidade de diagnóstico.

ABSTRACT: Bovine tuberculosis is an infectious disease with a high impact on the cattle industry, particularly in developing countries. PCR is a very sensitive method for detection of infectious agents, but the sensitivity of molecular diagnosis is largely dependent on the efficiency of the DNA extraction methods. The objective of this study was to evaluate DNA extraction methods for direct detection of Mycobacterium bovis in bovine tissue. Nine commercial kits for DNA extraction were evaluated when combined with two real time PCRs. The DNeasy Blood & Tissue Kit from QIAGEN showed better performance and sensitivity followed by the DNA Mini Kit RBC and FTA Elute Micro Card. Results suggested that, even when the analytical sensitivity of the qPCR is very high, the extraction method can influence the diagnostic sensitivity.

https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20151489 7496 downloads

Estudo testa eficiência de métodos de extração de DNA para diagnóstico de tuberculose bovina
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Fonseca Júnior, Antônio Augusto

Ciência Rural

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Jun 2016, Volume 46 Nº 7 Páginas 2 - 2

Resumo: Pt En | Texto: Pt En | PDF: Pt | PDF: En

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Validation of the multiplex PCR for identification of Brucella spp.
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Orzil, Lívia de Lima

; Preis, Ingred Sales

; Almeida, Iassudara Garcia de

; Souza, Patrícia Gomes de

; Soares Filho, Paulo Martins

; Jacinto, Fabrício Barcelos

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

Ciência Rural

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Mai 2016, Volume 46 Nº 5 Páginas 847 - 852

Resumo: Pt En | Texto: Pt En | PDF: Pt | PDF: En

RESUMO: Validou-se neste trabalho uma técnica de PCR Multiplex (mPCR) para detecção de Brucella spp. em amostras de suspensão bacteriana, como ferramenta complementar no diagnóstico da doença. Esta técnica possibilita a caracterização do agente sem que seja necessária a realização de testes bioquímicos, o que diminui consideravelmente o tempo para o diagnóstico final, além de oferecer mais segurança ao analista ao diminuir o tempo de exposição ao agente infecioso. A validação foi realizada de acordo com o Manual de Testes de Diagnósticos da OIE (2008), seguindo as exigências presentes na norma de qualidade da ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005. A mPCR validada neste trabalho identificou as diferentes espécies de Brucella ( Brucella abortus , B. suis , B. ovis e B. melitensis ) em suspensão bacteriana, obtidas a partir de amostras de frigorífico. Além disso, discriminou os biovares (1, 2 e 4; 3b, 5, 6 e 9) de B. abortus , de forma agrupada, e diferenciou cepa vacinal de cepa de campo, sendo esta uma técnica rápida, útil e de menor custo para o auxílio no diagnóstico de brucelose no Brasil.

ABSTRACT: A multiplex PCR technique for detection of Brucella spp. in samples of bacterial suspension was validated as a complementary tool in the diagnosis of the disease. This technique allows the characterization of the agent without performing biochemical tests, which greatly reduces the time for a final diagnosis, and provides more security for the analyst by reducing the time of exposure to microorganisms. The validation was performed in accordance with the Manual of Diagnostic Tests from OIE (2008) and following the requirements present in the ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005. The mPCR validated in this study identified the different species of Brucella ( Brucella abortus , B. suis , B. ovis e B. melitensis ) of bacterial suspension obtained from the slaughterhouse samples, as well as distinguished the biovars (1, 2 e 4; 3b, 5, 6 e 9) of B. abortus in grouped form and differentiated the field strains from vaccine strains, as a quick, useful and less expensive technique in diagnosis of brucellosis in Brazil.

https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20150065 13789 downloads

Validation of a real-time PCR assay for the molecular identification of Mycobacterium tuberculosis
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Sales, Mariana L.

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

; Orzil, Lívia

; Alencar, Andrea Padilha

; Silva, Marcio Roberto

; Issa, Marina Azevedo

; Soares Filho, Paulo Martins

; Lage, Andrey Pereira

; Heinemann, Marcos Bryan

Brazilian Journal of Microbiology

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Dez 2014, Volume 45 Nº 4 Páginas 1362 - 1369

Resumo: En | Texto: En | PDF: En

Mycobacterium tuberculosis is the major cause of tuberculosis in humans. This bacillus gained prominence with the occurrence of HIV, presenting itself as an important opportunistic infection associated with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The current study aimed to develop a real-time PCR using Eva Green technology for molecular identification of M. tuberculosis isolates. The primers were designed to Rv1510 gene. Ninety nine samples of M. tuberculosis and sixty samples of M. bovis were tested and no sample of the bovine bacillus was detected by the qPCR. Statistical tests showed no difference between the qPCR and biochemical tests used to identify the Mycobacterium tuberculosis. The correlation between tests was perfect with Kappa index of 1.0 (p < 0.001, CI = 0.84 - 1.0). The diagnostic sensitivity and specificity were 100% (CI = 95.94% - 100%) and 100% (CI = 93.98% - 100%). This qPCR was developed with the goal of diagnosing the bacillus M. tuberculosis in samples of bacterial suspension. TB reference laboratories (health and agriculture sectors), public health programs and epidemiological studies probably may benefit from such method.

3401 downloads

10.

PCR em tempo real para diagnóstico da leucose enzoótica bovina
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Dias, Natanael Lamas

; Fonseca Júnior, Antônio Augusto

; Rodrigues, Daniel Sobreira

; Camargos, Marcelo Fernandes

Ciência Rural

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Ago 2012, Volume 42 Nº 8 Páginas 1434 - 1439

Resumo: Pt En | Texto: Pt En | PDF: Pt | PDF: En

O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.

The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.

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11.

Diagnóstico e genotipagem do vírus da pseudoraiva por nested-PCR e análise de restrição enzimática
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Fonseca Júnior, Antônio Augusto

; Carmagos, Marcelo Fernandes

; D'Ambros, Régia Maria Feltrin

; Braga, Alexandre Carvalho

; Ciacci-Zanella, Janice

; Heinemann, Marcos Bryana

; Leite, Rômulo Cerqueira

; Reis, Jenner Karlisson Pimenta dos

Ciência Rural

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Abr 2010, Volume 40 Nº 4 Páginas 921 - 927

Resumo: Pt En | Texto: Pt En | PDF: Pt | PDF: En

A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.

Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.

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